氮高效转基因水稻OsNRT2.3b对土壤氨氧化细菌群落多样性的影响

日期:2021-04-22 00:45:02 | 人气: 91005

本文摘要:文章内容以氮高效率转基因水稻OsNRT 2.3b 2个各有不同株系N-04 和N-08 为研究对象,以非转基因油亲本日本国斋藤(Nipp)为对比,在田里住宅小区实验标准下,设备氮和不施氮二种处理,应用转性梯度方向凝胶电泳(PCR-DGGE)技术性,剖析了氮高效率转基因水稻在成长期对土壤氨水解细菌生态系统多元性的危害。

文章内容以氮高效率转基因水稻OsNRT 2.3b 2个各有不同株系N-04 和N-08 为研究对象,以非转基因油亲本日本国斋藤(Nipp)为对比,在田里住宅小区实验标准下,设备氮和不施氮二种处理,应用转性梯度方向凝胶电泳(PCR-DGGE)技术性,剖析了氮高效率转基因水稻在成长期对土壤氨水解细菌生态系统多元性的危害。section 38= wx_fmt=png) padding:= border-width:=科学研究寻找,稻谷土壤氨水解细菌十分丰富度指数值在各成长期内种类间皆也不存有显著差别。二种处理标准下N-04 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数值仅有在拔节期与Nipp 有显著差别,其他生长期皆无显著差别;在舒氮标准下N-08 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数值在拔节期和出穗扬开花期与Nipp 不会有显著差别,不施氮标准下仅有拔节期经常会出现显著差别。二种处理标准下,N-04 的土壤氨水解细菌匀称度指数值与Nipp 相比全部成长期皆无显著差别,而N-08 在拔节期显著高过Nipp。

转录组测序结果显示,施氮和不施氮处理下氮高效率转基因水稻(N-08 和N-04)与Nipp 相比土壤中具有更强的亚硝化反应螺旋菌科(Nitrosospira)和亚硝化反应单胞菌科(Nitrosomonas)。科学研究强调,氮高效率转基因水稻在某些生长期对香农-威纳指数值和匀称度指数值有显著差别,且其更为不利提高土壤铵态氮向硝态氮的转换成。序言从1996 年到2015 年,全世界转基因作物累计种植总面积超出前所未有的20 亿hm2,转基因作物早就沦落现代化农业有史以来拓张尤其迅速的粮食作物,但转基因作物在给大家带来巨大经济收益的另外,其所带来的绿色生态安全系数难题也日渐引起群众的广泛瞩目,尤其是在是对土壤微生物菌种生态系统多元性的危害。

有科学研究强调,转基因水稻棉絮的种植能使土壤细菌和细菌的总数持续上升,使其生态系统组成产生变化,也是有参考文献报道转基因作物的种植仍未对土壤微生物菌种群落结构造成显著危害。殊不知,要更为掌握点评转基因植物对土壤微生物菌种的危害,在科学研究剖析总体微生物菌种生态系统的全过程中,还不应科学研究转基因植物对土壤命令性微生物菌种的危害。氨水解细菌做为微生物菌种生物学科学研究的命令性微生物菌种,另外也是执行生物固氮第一步(将氨水解为亚硝酸钠即硝化反应速度约束性流程)的重要微生物菌种,在土壤营养物循环系统中占有最重要影响力,但其生态系统组成更非常容易不会受到气候条件、土壤运用方法和植被类型等的危害,因而遭受涉及到行业生物学家的广泛瞩目。

氮高效率转基因水稻OsNRT 2.3b 是运用转基因技术将稻谷高亲和力磷酸盐运送蛋白质OsNRT 2.3b 遗传基因引进蛋白激酶而获得的强力传递原材料。Fan 等和唐仲科学研究寻找,与基本稻相比,OsNRT 2.3b 强力传递株系中积累的营养物总产量提高了21%,铵态氮汲取速度提高了12%,营养物利用率提高了40%,单棵生产量提高了30%。因为土壤氮循环长时间正处在一个稳定平衡的情况,氮高效率转基因水稻的种植必定会从土壤中汲取更强的营养物,变化土壤营养物动态性特点,从而有可能危害土壤氨水解细菌群落结构。

本科学研究应用PCR-DGGE 技术性,以氮高效率转基因水稻OsNRT2.3b 的2个各有不同株系N-04 和N-08 为目标,科学研究其土壤氨水解细菌16S rDNA 遗传基因群落结构及多元性组成,为科学研究点评氮高效率转基因水稻对土壤微生物菌种的危害获得理论来源。1 原材料与方式1.1实验地概述与试验设计实验在财政部生态环境保护科学研究检测所网房间内进行,种植住宅小区四周及底端为钢筋混凝土,内科长、长、低皆为1 m,小区域内土壤为天津津南区仍未种植过农作物的潮土,仅有磷成分1.19 g·kg-1,全氮成分0.96 g·kg-1,土壤有机质成分24.55 g·kg-1,pH 8.21。实验应用基本上任意区组设计方案,设备氮和不施氮二种处理,5 次不断。

氮源(20 g·m-2)为尿素溶液[CO(NH2)2],在其中50%用以底肥,50%未作施肥,施肥在稻谷抽穗中后期服药。各自以磷酸二氢钾(P2O5:15 g·m-2)和硫酸铵(K2O:18 g·m-2)做为磷钾肥和钾肥,所有用以底肥。1.2供试原材料实验常用稻谷为氮高效率转基因水稻OsNRT 2.3b的2个各有不同株系N-04 和N-08 及非转基因油亲本日本国晴Nipp,皆由南京农大資源与环境生态工程学校植物营养生物学试验室获得。

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水稻种子于2015 年5 月8 日采摘于培养盘里,每穴5 粒,于6 月25 日移栽,筛出涨势完全一致的稻谷苗,每一个小区域内剪修稻谷20 株。1.3土壤试品搜集各自于稻谷分蘖期(7 月27 日)、拔节期(9 月8日)、出穗扬开花期(10 月10 日)和成熟(11 月12 日)搜集土样。搜集土样时,去除表层野草和干枝枯叶,用直徑3.5 cm 的土扣环在距稻谷叶柄2 cm 处取20 cm 浅的土样,每住宅小区3 个取样点。将每个住宅小区的试品各自混和,放置-20 ℃电冰箱,作为土壤氨水解细菌生态系统多元性剖析。

1.4测定法1.4.1土壤微生物菌种总DNA 提纯本科学研究应用Mo Bio 企业的Powerlyzer powersoilDNA isolation kit(Mo Bio laboratories,Solana Beach,CA,USA)检测试剂盒,取于0.5 g 鲜土放置Glass Bead Tube 中,按作业者表述逐渐进行提纯,将提纯到土壤的DNA 用1.5%的琼脂糖电泳检验试品品质,并于-20 ℃存留。1.4.2PCR 扩大应用巢式PCR(Nested PCR)方式扩大氨水解细菌16S rDNA 基因序列,引物设计及反映标准闻表格1。第一轮PCR 反映物质尺寸为465 bp,PCR 反映管理体系为50 μL(二种引物设计各0.5 μL,Premix Ex Taq 25 μL,融解2 倍的土壤DNA 模版5 μL,用消毒液填补至50μL);第二轮PCR 反映物质尺寸为250 bp,PCR 反映管理体系为50 μL(二种引物设计各0.5 μL,Premix Ex Taq 25μL,第一轮PCR 物质5 μL,用消毒液填补至50 μL)。

1.4.3形变梯度方向凝胶电泳(DGGE)检验及条带多次重复使用PCR 物质应用Bio-Rad 企业的DcodeTM 规范化基因变异监测系统(Bio-Rad,USA),依照作业者表述进行检验。关键流程以下:浓度值为8%的絮凝剂,转性梯度方向为40%~60%(100%变性剂含有7 mol·L-1 尿素溶液和40%(V/V)去正离子甲酰胺),60 ℃充压,将30 μL PCR物质(与loading buffer 实混好)重进胶孔,先在60 ℃、60 V 稳定工作电压下预跑30 min,随后在60 ℃、150 V 电泳原理6 h。电泳原理完后用SYBR Green Ⅰ(1∶10 000)上色30 min,再次用Gel Dox XR 疑胶光学电子系统(Bio-Rad)进行认真观察与相片,选择关键条带割胶多次重复使用。

1.4.4条带纯化复制及转录组测序核查多次重复使用后的条带用没有GC 铁夹的338f 和518r 引物设计进行扩大,PCR 物质历经电泳分析确定为单一条带后,应用Wizad R SV Gel and PCR Clean-Up system 实验试剂(Progema,USA)纯化,并与媒介pGEM -T EasyVector(Progema,USA)相接转换成(4 ℃培养8 h),挑取培养后的乳白色菌体预苗到LB 液体培养基中,37 ℃选矿摇床培养8 h,呈阳性复制送过来出有转录组测序。转录组测序結果在NCBI 上经Blast 核查剖析,获得类似典型性菌种编码序列。1.5数据统计分析应用SAS 9.1.3(Tukey′s test)对实验数据信息进行剖析,Quantity One 4.6.2 手机软件进行智能化处理并进行聚类分析法。

土壤氨水解细菌16S rDNA 基因多样性应用香农-威纳指数值(Shannon-Wiener index,H)、匀称度(Evenness index,En)和十分丰富度(Richness,S)来点评,其计算方法以下: H=-ΣPilnPiEn=H/lnS式中:H 意味着香农-威纳指数值;Pi 意味着第i 条带占据总抗压强度的比率;En 意味着匀称度指数值;S 意味着十分丰富度指数值。2 結果与剖析2.1土壤氨水解细菌16S rDNA 遗传基因DGGE 图普剖析DGGE 结果显示,各成长期N-04、N-08 和Nipp在舒氮和不施氮处理标准下DGGE 指纹图谱多见总共条带,仅有一小部分属于差别条带。在舒氮标准下(图1),N-04 仅有在拔节期与Nipp 有2 条差别条带(1B-2 和1B-4);N-08 在分蘖期、出穗扬开花期和成熟与Nipp 有4 条差别条带(1A-3 和1A-5;1C-4;1D-5)。不施氮处理标准下(图2),N-04 在分蘖期、出穗扬开花期和成熟与Nipp 各有1 条差别条带(2A-2;2C-5;3D-4);N-08 在4 个成长期与Nipp 总共8 条差别条带(2A-5 和2A-7;2B-1;2C-3、2C-4、2C-6 和2C-8;3D-6)。

2.2土壤氨水解细菌16S rDNA 基因多样性剖析依据DGGE 指纹图谱中每条条带的灰度值比例,对种植N-04、N-08 和Nipp 的土壤氨水解细菌16SrDNA 遗传基因十分丰富度指数值(S)、香农-威纳指数值(H)和匀称度指数值(En)进行剖析。結果寻找,在舒氮和不施氮标准下,N-04 和N-08 的土壤十分丰富度指数值与Nipp 在各成长期内皆仍未经常会出现显著差别(表格2 和表格3)。施氮标准下,N-08 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数值在拔节期时显著高过Nipp,而在出穗扬开花期显著小于Nipp,N-04 的在分蘖期、拔节期和成熟皆仍未经常会出现显著差别,仅有在出穗扬开花期显著高过Nipp(表格2);不施氮标准下,N-08 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数值在分蘖期、出穗扬开花期和成熟皆仍未经常会出现显著差别,仅有在拔节期显著小于Nipp,N-04 除出穗扬开花期显著高过Nipp 外,其他各阶段与Nipp 皆无显著差别(表格3)。

在舒氮和不施氮标准下,N-04 各成长期土壤氨水解细菌匀称度指数值与Nipp 皆无显著差别(表格2);N-08 仅有在拔节期显著高过Nipp,其他生长期仍未与Nipp 造成显著差别(表格3)。2.3土壤氨水解细菌16S rDNA 高通量测序結果及系统发育剖析依据土壤氨水解细菌DGGE 指纹图谱(图1 和图2)及条带灰度值比例值尺寸,在舒氮标准下选择32条条带上,不施氮标准下选择29 条条带上,进行复制转录组测序,请示NCBI 编码序列核查剖析。

結果寻找各选择条带与不明编码序列相仿度皆在96%~100%中间(表格4 和表格5),将转录组测序获得的基因序列与Genbank 别的相仿编码序列比照,绘图系统发育树根并进行系统发育剖析(图3 和图16)。从系统发育树根能够显出,施氮处理标准下32 个呈阳性复制和不施氮处理标准下29 个呈阳性复制关键属于不可以培养β-形变菌纲(Uncultured beta proteobacterium)、亚硝化反应螺旋菌科(Nitrosospira sp.)和亚硝化反应单胞菌科(Nitrosomonas sp.),在其中N-08 的优点科为亚硝化反应螺旋菌科(Nitrosospira sp.),N-04 和Nipp 的优点科皆为不可以培养β-形变菌纲(Uncultured beta proteobacterium)。依据土壤氨水解细菌DGGE 指纹图谱及条带核查結果寻找,在舒氮处理标准下,各成长期内N-08属于β-形变菌门的亚硝化反应单胞菌科(Nitrosomonassp.)的条带总共6 条,属于β-形变菌门的亚硝化反应螺旋菌科(Nitrosospira sp.)的有3 条,N-04 属于所述菌属的条带总共6 条,而Nipp 有5 条(表格4)。

不施氮标准下,N-08 属于β-形变菌门的亚硝化反应单胞菌科(Nitrosomonassp.)和亚硝化反应螺旋菌科(Nitrosospira sp.)的条带总共6 条,N-04 则有5 条,Nipp 仅有1 条属于亚硝化反应螺旋菌科(Nitrosospira sp.)的条带,仍未寻找属于亚硝化反应螺旋菌科(Nitrosospira sp.)的条带,且该条带属于三种小麦品种总共条带(表格5)。从而能够显出, N-08 和N-04 属于亚硝化反应螺旋菌科(Nitrosospira sp.)和亚硝化反应单胞菌科(Nitrosomonas sp.)的杂带总数显著小于Nipp。3 争辩现阶段有关转基因水稻生态环境保护安全评价的研究关键集中化于在遗传基因改变、靶点及非靶点微生物的危害及其农牧业生态环境保护等层面。

转基因生物出狱后否对土壤微生物菌种造成危害,近年来已沦落研究网络热点。陈丽华等研究寻找抗真菌药转基因水稻秸杆水解对土壤细菌总数的危害不显著,且转基因水稻土壤试品与非转基因油土壤试品中土壤细菌的十分丰富度、多元性指数、匀称度指数皆也不存有显著差别。但陈晓雯等却寻找并转Cry1Ac 遗传基因和并转Cry1Ab 遗传基因稻谷在生长发育充足阶段,土壤中细菌总数显著小于非转基因油亲本稻谷,但是这类危害的延迟时间较短。

陈丽华等也确认了广谱抗细菌蛋白质转基因水稻秸杆水解对土壤可培养细菌数和细菌群落结构有影响,但所造成的危害是一段时间的、不不断的。本研究寻找,N-08 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数在舒氮标准下的出穗扬开花期和施于氮标准下的拔节期皆显著小于Nipp,其他阶段无显著差别。这与Jin 等的研究結果完全一致,其也寻找转基因大豆的土壤氨水解细菌香农-威纳指数仅有在采摘期显著上升。

本研究还寻找N-04 与Nipp 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数在舒氮和施于氮处理标准下皆无显著差别(除出穗扬开花期外),表述氮高效率转基因水稻自身对土壤氨水解细菌的危害也是一段时间的,但各有不同栽种处理、各有不同成长期中间土壤氨水解细菌香农-威纳指数差别较小。这与金盘丝等对转基因大豆土壤微生物菌种生态系统水准的研究結果相仿。

Heuer 等对并转T4 溶菌酶遗传基因土豆根际微生物菌种群落结构的研究,也寻找其关键与时节、种植地址和年代相关。文中对土壤氨水解细菌匀称度指数的研究寻找,在二种能够氮处理标准下,N-08 与Nipp 的土壤氨水解细菌匀称度指数在分蘖期、出穗扬开花期和成熟皆无显著差别,仅有在拔节期显著高过Nipp。

邵婧鑫、徐广惠也证实了这一状况,其寻找转基因大豆的土壤氨水解细菌匀称度指数仅有在生长发育充足阶段显著高过非转基因油种类。董莲华等的研究也寻找,并转Bt CpTI 遗传基因抗虫棉的土壤氨水解细菌匀称度指数在花铃期显著高过非转基因油原材料,且其他阶段皆仍未寻找明显差别,与本研究結果也完全一致,表述氮高效率转基因水稻对土壤氨水解细菌匀称度指数的危害是一段时间的。亚硝化反应单胞菌科(Nitrosomonas sp.)在生物固氮第一阶段亚生物固氮中起主导地位,能够提高NH4 水解成NO2-,具有允许二氧化碳同样的工作能力,亚硝化反应螺旋菌科(Nitrosospira sp.)可做为硝化反应细菌,将亚硝酸钠水解为磷酸盐。

本研究中施氮和施于氮处理下,氮高效率转基因水稻(N-04 和N-08)土壤中属于亚硝化反应螺旋菌科(Nitrosospira sp.)和亚硝化反应单胞菌科(Nitrosomonas sp.)的氨水解细菌显著低于Nipp。因而,N-04 和N-08 的种植不会有提高土壤中铵态氮水解为硝态氮的有可能。本研究对各成长期土壤硝态氮和铵态氮成分也进行了剖析(研究結果仍未在原文中所列),結果寻找N-08 和N-04 在生长发育充足阶段土壤硝态氮成分显而易见显著小于Nipp,而铵态氮成分显著高过Nipp,也更进一步证实了氮高效率转基因水稻的种植不利土壤铵态氮向硝态氮的转换成。

4 结果(1)各成长期内氮高效率转基因水稻(N-04 和N-08)和非转基因水稻(Nipp)在舒氮和施于氮处理标准下DGGE 指纹图谱多见总共杂带。(2)N-04 和N-08 的土壤氨水解细菌香农-威纳指数和匀称度指数仅有在某些阶段与Nipp 造成显著差别,表述氮高效率转基因水稻自身对土壤氨水解细菌生态系统多元性的危害是一段时间的。(3)氮高效率转基因水稻(N-04 和N-08)土壤中属于亚硝化反应螺旋菌科(Nitrosospirasp.)和亚硝化反应单胞菌科(Nitrosomonassp.)的氨水解细菌显著低于Nipp,表述氮高效率转基因水稻的种植不利土壤铵态氮向硝态氮的转换成。


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